接着上一期的话题，我们知道 HBV cccDNA 目前常用的检测方式是 PCR 法。那么除了之前提到的微滴数字 PCR 以及滚环扩增 PCR 还有哪些检测 cccDNA 的方法呢?

3.原位杂交 PCR

IS-PCR 是 PCR 和原位杂交(in situ Hybridization, ISH)的结合, 最早由 Haase 等人 [83]在 1990 年提出。

IS-PCR 兼具 PCR 和 ISH 的优点, 并被用于肝脏组织切片中病毒基因组或复制中间体的原位扩增,可在单个细胞水平定位单个基因拷贝。

但其敏感性和特异性仍然是应用的主要挑战。1998 年, ISH 首次被报道用于 cccDNA 的检测, 它使用的是地高辛标记的单链探针检测可产 HBV 的 HepG2 细胞, 肝组织的中 cccDNA 未被检测。

该方法可以满足低含量核酸检测所需的灵敏度和特异性。RCA 联合 IS-PCR 具有二者的优点, 能敏感、特异地检测感染肝细胞中的 HBV cccDNA，在光镜下可观察到 HBV cccDNA 在肝组织中的分布和定位, 反映 cccDNA 表达水平与肝组织病理特征的关系, 以评价抗 HBV 治疗效果。

最近的技术发展为在特别制备的组织样本和细胞培养中可视化检测 cccDNA 提供 了新的可能性，其中包括 cccDNA 的荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)检测。

该方法首次揭示了鸭乙型肝炎病毒 cccDNA 和核 HBV DNA 在模拟抗病毒治疗条件下的命运。

然而，cccDNA 的可视化目前仍然是不切实际的，因为样品制备困难，需要复杂的设备来在临床环境中监测 cccDNA。

4. 捕获杂交 PCR

2015 年首次在特定 cccDNA 捕获中引入磁性纳米颗粒, 通过变性释放捕获的 cccDNA, 并对传统的 qPCR 进一步加工。

该方法设计了特异性捕获 HBV cccDNA 的功能化纳米颗粒, 该颗粒由链霉亲和素修饰, 然后与生物素标记 cccDNA 特异性寡核苷酸偶联。

在检测前对磁性纳米颗粒-链霉亲和素-生物素-cccDNA 探针复合物进行了优化, 并证明其 能与 cccDNA 特异杂交。

与直接实时荧光定量 PCR 相比, 对于磁性捕获杂交qPCR(magnetic capture hybridization qPCR, MCH-qPCR)方法，高含量的 HBV DNA 不影响 cccDNA 的检测，cccDNA 与 rcDNA 之间无交叉反应性。

新型 MCH-qPCR 方法具有良好的灵敏度和特异性, 可满足临床常规检测要求。但是由于该方法所需要的材料成本高, 限制了其在针对 cccDNA 的高通量药物筛选中的应用。

检测方法评价

无论采用何种方法, 在临床实践和高通量药物筛选中直接进行 cccDNA 动态监测目前 尚难以实现，促使了研究者探索和发展其他与 cccDNA 高度相关的替代检测指标。

近 10 年以来, 不断有研究者评估验证与 cccDNA 水平相关的 HBV 血清抗原和核酸指标。

整体看来, 根据现有报道数据血清 HBcrAg 与 cccDNA 相关性相对更优，HBeAg 次之, HBV DNA 和 HBsAg相关性相对较差。

当然 HBeAg 仅在部分患者中可被测及, 而 HBsAg 在全部的慢性乙肝患者中均适用。

血清 HBV RNA 是近年来报道的新指标，研究认为与肝细胞内 cccDNA 的转录活性有关,，在评估抗 HBV 治疗停药后复发风险中具有临床价值，但其与 cccDNA 的实际相关性尚待进一步研究。