张俊海，解放军306医院，神经外科

1989 年，Janeway 提出了病原体和宿主先天性免疫防御之间存在分子模式识别受体(patternrecognitionreceptor, PRR) 的假说.

研究显示，作为炎症反应的中心环节，炎性小体与很多疾病密切相关。其中，与NLRP3 炎性小体相关疾病较多。首先是遗传性疾病。最初发现与炎性小体相关的疾病是穆- 韦氏综合征，属Cryopyrin蛋白相关综合征，主要因基因突变导致NLRP3 炎症小体过度激活，产生过量的IL-1β。临床上使用IL-1β 抑制剂能缓解穆- 韦氏综合征患者的症状。其次是炎性疾病。一些晶体包括二氧化硅、石棉等也通过NLRP3 炎性小体来诱发肺部炎症反应。现有研究结果认为，急性肺损伤发生发展的重要因素之一是过度失调的炎症反应。同样，IL-1β 的靶向治疗能够缓解痛风和关节炎等疾病，提示炎性小体与该疾病也有关联，这在Martinon等 的研究中得到了证实。再次是一些慢性疾病。关于2 型糖尿病与炎性小体之间的关系，牵涉NLR的论据第一次由Tschopp 实验室提出，nlrp3 敲除的小鼠高脂饮食8 周后比野生型小鼠糖耐量更高，对胰岛素更敏感。Latz 实验室的工作表明，动脉粥样硬化的形成和NLRP3 炎性小体的激活有关。另一方面，阿尔兹海默病的淀粉样斑块、肌萎缩侧索硬化症中突变的SOD1、老年性黄斑变性中的玻璃膜疣以及相关疾病中的朊病毒 都可以激活NLRP3 炎性小体，但目前没有证据显示IL-1β或者IL-18 抑制剂对患者有益。Nlrp1 基因突变的小鼠，其祖细胞的死亡率明显增加，由于祖细胞在受到感染或者化疗时具有易感性，最终可以导致血细胞减少症。此外，nlrp1 基因突变也可以引发黑色素细胞功能异常所导致的白癜风。炎性小体对肿瘤的发生发展也有一定作用。Dinarello 指出，IL-1 能够介导趋化因子、基质金属蛋白酶、黏附因子等促进肿瘤转移的蛋白的表达，加速肿瘤的发展；在小鼠炎性肠病模型中，IL-18 的抑制剂能够减少肿瘤的发生率。在NLRs 家族蛋白中，NLRP3、NLRP6 和NLRC4 对结肠炎起作用，并且可以影响肿瘤的发生率。炎性小体也牵涉其他的癌症，包括皮肤癌和骨髓瘤，虽然还不知道是哪种炎性小体参与，但是在有些临床试验中，靶向IL-1 的治疗对皮肤癌和骨髓瘤是有益的。

在高等动物中迄今已发现至少四个家族的模式识别受体，其中一类位于细胞膜，如Toll 样受体(Toll-like receptor, TLR)和C 型凝集素受体(C-type lectin receptor, CLR) ；另一类位于细胞浆，如核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)，即NOD 样受体(NOD-like receptor, NLR) 和视黄酸诱导基因样受体(RIG-I-like receptor, RLR)。在先天性免疫防御系统中，PRR 主要识别外源病原体相关的

分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，如细菌和真菌细胞壁成分、病毒RNA 和DNA 及脂多糖等。炎性小体(inflammasome) 是一类细胞内参与先天性免疫防御功能，由胞浆PRR 参与组装的多蛋白复合体。2002 年，Tschopp 实验室首次提出炎性小体的概念，在细胞受到外界信号刺激或感染时，特定炎性小体招募并激活半胱天冬酶-1(caspase-1)，加工并使之成熟和分泌细胞因子白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)和白介素-18 (interleukin-18,IL-18)，提高机体抵御内源和外源刺激的能力，达到保护宿主的目的。炎性小体激活下游的caspase-1后可在细胞膜形成小孔，继而炎性因子大量释放，引起DNA 损伤，最终使细胞发生渗透性崩解，诱发程序性细胞死亡，即依赖caspase-1 的细胞凋亡(pyroptosis)。

1　炎性小体的结构和组成

炎性小体的相对分子质量约7 × 105，各种炎性小体的结构都有差异，但一般均含有caspase-1 和一种NOD 样受体家族蛋白或HIN200 (hemato-poieticIFN-inducible nuclear protein containing a 200-aminoacidrepeat) 家族蛋白。此外，某些炎性小体还含有凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-likeprotein containing CARD, ASC)。

1.1　Caspase-1

Caspase-1 是最先在哺乳动物细胞中鉴定的caspase 蛋白酶家族成员，与促炎症反应密切相关。细胞中的caspase-1 以无活性的酶原形式存在，激活后形成具有酶活性的异二聚体，由相对分子质量为1 ×104 和2 × 104 的两个亚基组成。当细胞受到危险信号刺激时，caspase-1 可通过与炎性小体结合而被激活，从而促进炎性因子成熟并释放，在炎症反应中起着核心调控作用。Caspase-1 对炎性因子pro-IL-1β 和pro-IL-18 都能够加工，但两者不一定同时被加工，如Francois 等就发现趋于死亡的肿瘤细胞释放三磷酸腺苷，进而激活炎性小体，并诱导IL-1β 的分泌，而不是IL-18 ；Zaki 等 也发现在右旋葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠大肠炎模型中，炎性小体介导的caspase-1 激活以及IL-18 的分泌可以对机体起到保护作用，而IL-1β 并没有释放。

1.2　NOD样受体蛋白

NOD 样受体蛋白( 即NLR) 是一类含有核苷酸结合寡聚结构域的蛋白家族，为胞浆内的模式识别受体。NLR 家族的主要特征是含有位于中间结构的核苷酸结合寡聚化区域(nucleotide-binding oligomerizationdomain, NACHT)，C 端的富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats, LRR)，还有N 端的caspase 激活和募集结构域(caspase activation andrecruitment domain, CARD) 或热蛋白结构域(pyrindomain, PYD)。LRR 具有识别受体和自我调节作用，CARD 和PYD 区域介导同型蛋白- 蛋白相互作用并传递给下游信号；NACHT 区域是唯一的NLR 家族同源结构，通过依赖三磷酸腺苷的寡聚化而激活下游信号。按照NACHT 区域的不同，NLR 家族可分为3 个亚家族：NOD、NLRP/NALP 和IPAF 。

1.3　黑素瘤缺乏因子2

黑素瘤缺乏因子2 (absent in melanoma 2, AIM2)是一种主要定位于细胞浆的蛋白质，其N 端含有PYD，C 端是寡聚核苷酸结合结构域(oligonucleotidebindingdomain, OB)。1997 年，美国和澳大利亚研究小组共同在黑色素瘤细胞中用消减cDNA 杂交的选择方法首次鉴定了AIM2，由于其在黑色素瘤中缺失，故命名为黑素瘤缺乏因子2，属于与免疫反应相关的HIN-200 家族。目前已鉴定出人类的4种HIN-200 成员， 分别为IFI16、MNDA、AIM2和IFIX。当双链DNA 释放到细胞质后，AIM2 可通过OB 结构域与双链DNA 直接结合，而不与单链DNA 结合 ，紧接着AIM2 的PYD 与ASC 的PYD 相互作用，诱导ASC 的二聚体化以及炎性小体的组装，ASC 再通过自身CARD 招募caspase-1，从而激发先天性免疫反应。

1.4　凋亡相关斑点样蛋白(ASC)

ASC 是一类含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶募集域和热蛋白样结构域的蛋白质。1999 年，ASC

由日本的Masumoto 等 在白血病细胞中发现，相对分子质量为2.2 × 104。细胞凋亡时，其在胞质中聚集成中空的斑点状，故称为凋亡相关斑点样蛋白。ASC 通过其同源蛋白相互作用结构域PYD 和CARD 的寡聚化来招募NLR 和caspase 蛋白酶，从而参与多条信号转导途径。

2　炎性小体的主要类型

目前研究比较清楚的炎性小体主要有4 种 ：NLRP1、NLRP3、IPAF 和AIM2 等炎性小体。其他的炎性小体，如NLRP6 等的生物学作用尚不明确。

2.1　NLRP1炎性小体

最初对炎性小体的描述是基于NLRP1 炎性小体的装配。NLRP1 炎性小体的结构包括N 端的PYD 结构域( 位于中心的NOD 和LRR)、C 端的FIIND (domain with function to find) 和CARD 结构域。因此，NLRP1 与其他NLR 蛋白不同，它有两个信号转导区域，即PYD 和CARD。淋巴瘤细胞粗提物实验表明，NLRP1 能形成一种显示IL-1β 加工活性的多蛋白复合物，包括ASC、CARD8、caspase-5 和caspase-1。之后利用纯化的成分对NLRP1 炎性小体重建实验表明，NLRP1 炎性小体的起码要素是NLRP1、三磷酸核苷酸和caspase-1。NLRP1 炎性小体的配体有胞壁酰二肽(muramyl dipeptide) 和炭疽杆菌致死毒素(lethal toxin)，并且基于最初的研究推测caspase-1 的激活是经过两个步骤：首先微生物的MDP 结合NLRP1 并改变其构象，允许其结合一个三磷酸核苷酸，然后通过NOD 诱导NLRP1 寡聚化，为caspase-1 的活化创造一个平台。受体分子ASC 对于caspase-1 的活化不是必需的，主要是因为人类NLRP1 能够通过CARD-CARD 相互作用直接结合caspase-1，但是ASC 可以增强caspase-1 的活化。目前仅有证据表明，钾离子外流对于NLRP1 炎性小体的激活是必需的。与人类单一的nlrp1 基因不同的是，小鼠中有3 个串联同源基因，即nlrp1a、nlrp1b、nlrp1c。此外，不同种系特异性等位基因存在nlrp1b，并且这些遗传变异使NLRP1b 能够作为炭疽杆菌致死毒素的感受器。

2.2　NLRP3炎性小体

在目前发现的各种炎性小体中，NLRP3 炎性小体是研究的最多且最清楚的，也是迄今为止发现配体数最多、最复杂的一种炎性小体, 主要由NLRP3、ASC 和caspase-1 组成。NLRP3 炎性小体的配体包括各种微生物及其毒素和细胞内危险信号，配体的不同决定了激活机制的不同。例如，白色念珠菌这类真菌是通过脾酪氨酸激酶(spleentyrosine kinase) 激活NLRP3 炎性小体 ；细菌是通过分泌穿孔素来活化NLRP3 炎性小体，包括李斯特菌、金黄色葡萄球菌 ；类似的激活机制还有仙台病毒、腺病毒、流感病毒等 ；细胞自身产生的危险信号包括受损细胞释放到胞外的三磷酸腺苷和透明质酸、β- 淀粉样蛋白、单钠尿酸和高血糖等。另外，外界刺激物，如二氧化硅、石棉、强烈紫外线和免疫佐剂等，也都能激活NLRP3 炎性小体。目前，有关NLRP3 炎性小体的激活通路都有各自的局限性，还存在很多争议，有以下3 种较为流行的激活假说。第一种是钾离子外流，钾外流与细胞内低钾和NLRP3 炎性小体的激活密切相关。Kanneganti 等 认为，细菌分泌的穿孔素破坏了细胞膜的完整性，胞外的三磷酸腺苷由于刺激也打开钾离子通道，进而加速了钾离子的外流，并招募间隙连接蛋白pannexin-1，形成质膜孔道，一些NLRP3 的配体通过小孔进入细胞内激活NLRP3 炎性小体。第二种是配体导致溶酶体破裂的物质，如一些配体的刺激，包括尿酸、二氧化硅、石棉、胆固醇晶体 和腺病毒等，会使细胞吞噬这些刺激物，导致溶酶体损伤并破裂，释放组织蛋白酶B，激活NLRP3 炎性小体。第三种是配体刺激产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)。目前发现所有的NLRP3 的配体都能诱导产生活性氧来激活NLRP3 炎性小体，并且ROS 的抑制剂或清除剂都能抑制NLRP3 炎性小体的激活。报道在线粒体呼吸链产生的ROS 应答中，硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin interacting protein) 能直接与NLRP3 结合，激活NLRP3 炎性小体，在此过程中自噬小体通过清除受损的线粒体来负调控线粒体ROS 的产生。虽然该机制有更好的适应性，但表1 炎性小体4种主要类型的激活方式及其配体问题还未完全解决，首先ROS 产生的具体来源并不清楚；其次一些其他能诱导产生ROS 的物质，如肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 却不能激活NLRP3 炎性小体，这说明 NLRP3 炎性小体的激活可能还需

要其他过程的参与。

最近发现，鸟苷酸结合蛋白5 (guanylate-bindingprotein 5, GBP5) 和双链RNA 依赖性蛋白激酶(doublestrandedRNA-activated protein kinase, PKR) 在NLRP3炎性小体活化中也发挥作用。GBP5 和NLRP3 的PYD 相互作用有助于炎性小体的寡聚化。研究显示，GBP5 缺陷的小鼠较野生型小鼠被感染后细菌负荷更多，疾病进展更快。PKR 本身具有抗病毒功能，PKR 结合双链DNA 后自磷酸化，活化转录抑制因子EIF2α，阻止转录并增加细胞对病毒的清除率。另外，PKR 通过封闭钙结合微丝蛋白来抑制肌动蛋白的切割活性，PKR 活化钙结合微丝蛋白有助于防御病毒的感染。

2.3　NLRC4炎性小体

NLRC4 炎性小体是所有已发现炎性小体中组成最简单的一种，由于NLRC4 含有一个CARD 结构域，能够直接招募pro-caspase-1。细菌鞭毛的主要成分鞭毛蛋白对NLRC4 炎性小体的活化起重要作用，通过革兰氏阴性菌的III、IV 型分泌系统感染细胞，即通过针孔状通道将效应蛋白注入到宿主细胞的胞质中，如沙门氏菌、嗜肺军团菌和铜绿假单胞菌。同时，NLRC4 炎性小体也能够被无鞭毛的细菌激活，如福式志贺菌，但具体机理尚不明确。虽然接头蛋白ASC 并不参与NLRC4炎性小体的组装过程。

2.4　AIM2炎性小体

AIM2 炎性小体是近年发现的，是先天性免疫学界的重大进展之一。与含有NLR 家族成员的其他3 种炎性小体不同，它还含有HIN-200 家族的AIM2 蛋白。AIM2 蛋白的N 端PYD 区能够招募ASC 蛋白，进而ASC 再通过CARD 结构域招募caspase-1。AIM2 炎性小体可识别胞质中的双链DNA，无论是病毒、细菌和宿主的双链DNA均可以和AIM2 的C 端HIN200 区域相互作用，使AIM2 发生寡聚化，从而促进炎性小体的形成。最新研究发现，土拉热弗朗西丝氏菌、牛痘病毒和小鼠巨细胞病毒都是AIM2性小体的配体，单增李斯特氏菌也能使之部分激活。土拉热弗朗西丝氏菌激活AIM2 炎性小体主要依赖于ASC 的募集，钾离子的外流导致细胞质中钾的耗尽，细胞的内吞以及溶酶体的酸化。AIM2 炎性小体在抗细菌和病毒免疫中均发挥重要作用，但其识别不同来源双链DNA 并产生炎性小体的具体机制还有待进一步研究。例如，研究显示鼠巨细胞病毒感染AIM2 和ASC 基因缺失的小鼠后，血浆IL-18 浓度降低，干扰素的产生明显减少，然而I 型单纯疱疹病毒刺激小鼠巨噬细胞产生 IL-1β 的过程却完全不依赖于AIM2 炎性小体。

2.5　其他炎性小体

NLRP6 炎性小体与NLRP3 炎性小体的结构相似。早期研究发现NLRP6 与ASC 在粒细胞和T 细胞中均表达，可激活NF-κB，诱导依赖caspase-1的细胞因子成熟，因此认为其具有炎性小体的活性。NLRP6 炎性小体能够预防结肠内炎症诱导肿瘤的产生，NLRP6 也可调节肠道菌群组成，维持肠道微生物平衡。最初发现NLRP12 对超敏反应起一定的作用，近年发现和NLRP3 类似，NLRP12 也和遗传性炎性疾病有关联。NLRP12 的成熟可以导致ASC 斑点的形成和caspase-1 的活化。NLRP12 可以通过对非经典NF-κB 信号进行负性调节来抑制结肠炎症和肿瘤的形成。Nlrp12 缺陷的小鼠对结肠炎性和肿瘤的形成具有高易感性，这和炎性因子、趋化因子和致瘤因子的产生增多有关。NLRP2广泛表达于组织和肿瘤细胞系中，NLRP2 转染进入巨噬细胞后能与ASC 协同促进caspase-1 活化及IL-1β 的分泌释放。

近年来，发现了越来越多的天然免疫相关分子，炎性小体在天然免疫及炎性疾病的发生发展中起重要作用，它能感受特定刺激，招募并激活caspase-1，产生IL-1β 和IL-18 等细胞因子。然而，是否存在其他类型的炎性小体，炎性小体的组装及活化的细节，针对炎性小体下游分子治疗药物的研发等很多问题尚未解决，这些问题的阐明将有助于人们更好地理解炎性疾病的发病机制，为治疗提供新的理论依据。